تولید گیاهان گوجه فرنگی تراریخته حاوی ژن پروانسولین انسانی

با به کار گیری فناوری های زیست ملکولی در گیاهان می توان بسیاری از داروها را به قیمت ارزان تر در گیاهان تولید نمود جذابیت سیستم های گیاهی به دلیل مزایایی همچون ایمنی بالا، هزینه پایین تغییرات پس از ترجمه وحجم بالای تولید است، که نسبت به سیستم های کلاسیک (مثل باکتری ها، مخمرها وسلول های جانوری ) دارند. پروتئین دارویی انسولین که برای درمان دیابت به کار میرود یکی از این مواد است. از راههای انتقال ژن به گیاه که به دلیل طبیعی بودن و راندمان بالا مقبولیت زیادی دارد استفاده از آگروباکتریوم برای انتقال ژن می باشد. گوجه فرنگی نیز یکی از گیاهان مدل، از نظر ژنتیکی است که به عنوان یک میزبان خوب برای آگروباکتریوم شناخته می شود. در این تحقیق نخست عوامل موثر بر روی انتقال ‍‍ژن از طریق آگروباکتریوم به گیاه گوجه فرنگی واریته cal-jn3 در این تحقیق مورد مطالعه قرار گرفت. ریز نمونه های کوتیلدونی به دست آمده از گیاه گوجه فرنگی 11 روزه ی واریته cal-jn3 که در درون شیشه ودر فیتوترون کشت شده بود با آگروباکتریوم تومورزا سویه lba4404 حامل ناقل pcambia 1304 که حاوی ژن گزینشگر مقاومت به هیگرومایسین (بیان کننده هیگرومایسین فسفوترانسفراز) وژن پروانسولین انسانی هست تلقیح شد شرایط مطلوب انتقال ‍ژن توسط آگروباکتریوم به واریته cal-jn3 که در این تحقیق بررسی وبهینه شدند عبارت بودند از: قرارگرفتن ریزنمونه های کوتیلدونی 11روزه در محیط کشت پیش تیمار شامل (ms جامد+ grl -1 30ساکارز + mgl -1 2 ازهورمون tdz) به مدت 24-48 ساعت سپس آلودگی نمونه های کوتیلدونی با سوسپانسیون آگروباکتریومی با 1 =od 260 به مدت 10 دقیقه وبعد از خشک کردن نمونه ها، به مدت 24 ساعت در محیط هم کشتی مشابه محیط پیش تیمارقرارگرفتند و سپس به محیط کشت پیش انتخابی حاوی (ms جامد+ grl -1 30 ساکارز+ mgl -1 2 هورمون tdz+ سفوتاکسیم) انتقال یافتند بهترین غلظت آنتی بیوتیک سفوتاکسیم گیاه mgl -1 300 وبه مدت 4 روز در این تیمار قرار گرفتند. در مرحله بعدی نمونه ها به محیط کشت انتخابی انتقال یافتند که علاوه برترکیبات بالا حاوی آنتی بیوتیک هیگرومایسین بهترین غلظت آنتی بیوتیک هیگرومایسین برای جدا کردن گیاهان تراریخته احتمالی طی آزمایشی 25 میلی گرم بر لیتر تعیین شد. سپس نمونه ها به منظورباززایی مستقیم بر روی محیط کشت هایی حاوی ترکیبات ms، grl -1 30 ساکارز ونسبت های مختلف هورمونی شامل نسبت های (mgl -11،2،3 ) هورمون bap ، ( mgl -11،2،3) هورمون tdz، ونسبت های هورمونی شامل(1 به 0.05-2به0.05-3 به 0.05 ) میلی گرم بر لیتر bap به naa که ph همه تیمارها روی7/5 تنظیم شده بود، کشت شدند وداخل اتاقک کشت با دمای شب 17 درجه سانتیگراد و روز25 درجه سانتیگراد با 8 ساعت تاریکی و16 ساعت روشنایی قرار گرفت و طی چهار هفته از دوجنبه تعداد ریز نمونه های باززایی شده وتعداد شاخه در هر نمونه بررسی شدند..نتایج به دست آمده نشان داد بهترین تیمارها ازنظر تعداد نمونه های باززایی شده mgl -1 2 هورمون tdz بود وmgl -12 هورمونbap بین سطوح bap ترجیح داده می شود واز نظر تعداد شاخساره بیشترین تعداد شاخه متعلق به تیمارهاییmgl -12 هورمونtdz بود بهترین تیمار برای ریشه زایی نیز متعلق به تیمار 2/1 ترکیبات ms، grl -1 20 ساکارز، grl -18 آگار وmg l-1 1 هورمون ایندول بوتیریک اسید بود که بهترین تاثیر را بر روی ریشه زایی داشتند. گیاهان سپس به گلدان وگلخانه منتقل شدند. وجود ژن مقاومت به هیگرومایسین وپروانسولین در گیاهان رشد یافته در محیط کشت انتخابی حاوی هیگرومایسین با pcrبه اثبات رسید. همچنین بررسی در سطحrna نیز صورت گرفت و با ساخت cdna و pcr بیان ژن در سطح rna نیز نشان داده شد.